Pewarnaan Kinyoun: pondasi dan teknik

Pewarnaan Kinyoun adalah teknik pewarnaan yang digunakan untuk menodai bakteri dan parasit yang tahan asam. Itu lahir dari modifikasi pewarnaan Ziehl-Neelsen; Kedua teknik ditafsirkan dengan cara yang sama tetapi mereka berbeda dalam dua elemen: dalam penyusunan reagen utama dan bahwa teknik Kinyoun tidak menggunakan panas.

Untuk alasan ini juga dikenal sebagai pewarnaan dingin Ziehl-Neelsen atau Kinyoun yang dimodifikasi dingin. Ini diindikasikan untuk warna Mycobacterium tuberculosis, Micobacterium leprae, mycobacteria atipikal, Nocardias sp, Cryptosporidium parvum, Cryptosporidium meleagridis, Cryptosporidium felis, Cryptosporidium muris dan Cryptosporidium muris dan Cyclosporas cayetanensis .

Patut dicatat bahwa Nocardias bernoda lemah dengan teknik ini karena mereka sebagian alkohol tahan asam, jadi untuk genre ini ada modifikasi metodologi.

Pada gilirannya, teknik dingin Kinyoun telah digabungkan dengan teknik trikom dimodifikasi oleh Didier untuk mendeteksi coccidia ( Criptosporidium parvum dan Isospora belli ) dan spora microsporidia ( Enterocytozoon bieneusi dan Encephalitozoon intestinalis ).

Yayasan

Pereaksi pewarnaan utama adalah carbol fuchsin atau fenicaine fuchsin, yang memiliki sifat mengikat asam karbol di dalam dinding sel lilin, kaya akan lipid (asam mikolik) dari mikobakteri dan parasit tertentu.

Persatuan itu tidak dilawan dengan penghilangan warna asam; oleh karena itu, mikroorganisme didefinisikan sebagai alkohol tahan asam.

Berbeda dengan teknik Ziehl-Neelsen - yang memperbaiki pewarna melalui panas - dalam teknik Kinyoun langkah ini tidak diperlukan, karena larutan fenolik fuchsin yang disiapkan untuk teknik ini mengandung konsentrasi fenol yang tinggi.

Fenol melarutkan bahan lipid dari dinding sel, yang memungkinkan masuknya pewarna carbol fuchsin. Setelah pewarna menembus, tetap diperbaiki meskipun dicuci dengan alkohol-asam.

Dengan cara ini, mikroorganisme yang tahan asam memiliki warna merah yang khas, sementara segala sesuatu yang bukan alkohol yang tahan asam berubah warna dan berwarna biru.

Teknik

Material

- Modifikasi fenolik fuchsin.

- Asam alkohol.

- Metilen biru.

Persiapan Kinyoun fenicated fuchsin

- Basic fuchsin: 4 gr.

- Fenol: 8 ml.

- Alkohol (95%): 20 ml.

- Air suling: 100 ml.

Fuchsin dasar dalam alkohol harus dilarutkan perlahan-lahan, terus dicampur. Selanjutnya, fenol yang dikristalisasi dilebur dalam penangas air pada 56 ° C. Setelah larut, 8 ml ditambahkan ke larutan fuchsin yang disiapkan di atas.

Persiapan asam alkohol

- Asam klorida pekat: 3 ml.

- Etanol (95%): 97 ml.

Itu harus diukur, bergabung dan dicampur.

Persiapan pewarna kontras biru metilen

- Metilen biru: 0, 3 g.

- Air suling: 100 ml.

Beratnya dan larut.

Teknik pewarnaan kinyoun

1- Siapkan apusan langsung dari sampel, yang bisa berupa dahak, cairan paru, sedimen urin, cairan serebrospinal atau tinja, antara lain; atau dari suspensi mikroorganisme yang diperoleh dari koloni murni yang tumbuh di media kultur primer.

2- Perbaiki apusan dengan panas.

3 - Letakkan apusan pada jembatan pewarnaan dan tutup dengan reagen fuchsin fenolik Kinyoun yang disiapkan. Biarkan selama 3 atau 5 menit.

4 - Cuci dengan air suling.

5- Pemutih dengan alkohol asam selama 3 menit dan cuci lagi dengan air suling.

6 - Bleach lagi dengan alkohol asam selama 1 atau 2 menit sampai tidak ada lagi pewarna yang terseret.

7- Cuci dengan air suling dan biarkan mengalir, menempatkan slide dalam posisi vertikal.

8- Tutupi persiapan dengan biru metilen dan biarkan selama 4 menit.

9- Cuci dengan air suling dan biarkan udara kering.

10- Periksa pada 40X dan kemudian pada 100X.

Jika Anda ingin memperbaiki dan mempercepat pewarnaan mikroorganisme tahan asam, tambahkan 1 tetes bahan pembasah (seperti tergitol No. 7) ke 30 atau 40 ml asam fuchsin asam furunin Kinyoun.

Beberapa laboratorium mengubah pewarna kontras biru metilen untuk asam hijau terang atau pikrat; yang pertama memberi warna hijau ke latar belakang dan yang kedua menghasilkan warna kuning.

Teknik Kinyoun khusus untuk Nocardias

Untuk meningkatkan pewarnaan bakteri Nocardia, modifikasi pewarnaan Kinyoun digunakan. Tekniknya adalah sebagai berikut:

1- Tutupi apusan dengan Kinyoun phenolic fuchsin selama 3 menit.

2- Cuci dengan air suling.

3 - Blush sebentar dengan alkohol asam 3% sampai tidak ada lagi pewarna yang ditahbiskan.

4- Cuci lagi dengan air suling.

5- Tutupi persiapan dengan biru metilen dan biarkan selama 30 detik.

6- Cuci dengan air suling dan biarkan udara kering.

Teknik gabungan fuchsin fenolik dan trichromic dimodifikasi oleh Didier

Teknik ini direkomendasikan untuk analisis sampel tinja untuk mencari coccidia dan spora dari Microsporidium sp pada saat yang bersamaan. Prosedur yang harus diikuti adalah sebagai berikut:

1- Tutupi apusan dengan Kinyoun phenolic fuchsin selama 10 menit.

2- Lepaskan pewarna dan cuci dengan air suling.

3- Pemutih selama 30 detik dengan alkohol asam klorida.

4- Cuci lagi dengan air suling.

5- Tutupi apusan dengan larutan trichrome selama 30 menit pada suhu 37 ° C.

6- Cuci dengan air suling.

7- Dekolorisasi selama 10 detik dengan asam asetat alkohol.

8- Cuci apusan selama 30 detik menggunakan etanol 95%.

Kontrol kualitas

Sebagai kontrol positif, apusan disiapkan dengan strain Mycobacterium tuberculosis dan diwarnai dengan reagen yang disiapkan untuk memverifikasi bahwa bakteri mengambil warna yang tepat (red-fuchsia).

Kontrol negatif juga dapat digunakan dengan membuat apusan dengan strain apa pun yang tidak tahan alkohol asam, sehingga memverifikasi bahwa seluruh sampel mengambil warna kontras.

Teknik Kinyoun dibandingkan dengan teknik Ziehl -Neelsen

Teknik Kinyoun lebih sederhana karena menghilangkan langkah pemanasan, tetapi keunggulan utamanya adalah mencegah emisi uap, sangat beracun dan menyebabkan kanker dalam jangka panjang. Oleh karena itu, pewarnaan Kinyoun lebih aman bagi personel yang bertugas pewarnaan.

Penting untuk mempertimbangkan bahwa perlu diperhatikan bahwa pereaksi tidak bersentuhan langsung dengan kulit, karena bersifat korosif dan pemutih mudah terbakar.

Mengenai kekurangannya, apusan negatif tidak selalu menunjukkan bahwa mikroorganisme tidak ada. Selain itu, keberadaan detritus sel dapat menyebabkan positif palsu, yang menimbulkan kebingungan dalam diagnosis.

Referensi

1. Kimia Klinik Terapan (2016). BK Kinyoun Kit. Tersedia di: cromakit.es
2. Orozco-Rico Miguel. Noda Kinyoun dan dua Coccidia dalam HIV. Jurnal Medis MD. 2011; 3 (2): 137
3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A (2009). Diagnosis mikrobiologis Bailey & Scott. 12 ed. Argentina Editorial Panamericana SA
4. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnosis mikrobiologis. (Edisi ke-5). Argentina, Editorial Panamericana SA
5. Kontributor Wikipedia. «Noda Kinyoun.» Wikipedia, Ensiklopedia Bebas . Wikipedia, Ensiklopedia Gratis, 8 Februari 2018. Web. 5 Januari 2019.
6. Combol A, Fernández N, Figueredo E, Acuña A, Zanetta E. Implementasi teknik pewarnaan untuk diagnosis simultan Coccidia dan Microsporidia. Institut Kebersihan Universitas Republik. Montevideo. Uruguay Tersedia di: higiene.edu.uy