Uji katalase: pondasi, teknik dan kegunaan
Uji katalase adalah metodologi yang digunakan di laboratorium bakteriologi untuk menunjukkan keberadaan enzim katalase pada bakteri yang memilikinya. Seiring dengan pewarnaan Gram adalah tes utama yang harus dilakukan pada mikroorganisme yang baru saja diisolasi. Tes-tes ini memandu ahli mikrobiologi pada langkah-langkah untuk mengikuti identifikasi definitif mikroorganisme yang dimaksud.
Secara umum, bakteri yang mengandung sitokrom memiliki enzim katalase, yaitu bakteri anaerob aerob dan fakultatif yang harus memilikinya. Namun, ada pengecualian, seperti Streptococcus, yang meskipun mikroorganisme anaerob fakultatif tidak memiliki enzim katalase.
Itulah sebabnya uji katalase digunakan terutama untuk membedakan famili Staphylococaceae dan Micrococaceae (keduanya katalase positif) dari famili Streptococaceae (katalase negatif).
Demikian juga, genus Bacillus (katalase positif) dibedakan dari genus Clostridium (katalase negatif), antara lain.
Yayasan
Katalase adalah enzim yang diklasifikasikan sebagai hidroperoksidase, ini berarti bahwa mereka menggunakan hidrogen peroksida (H2O2) sebagai substrat.
Ini juga dianggap sebagai oksidoreduktase, karena dalam reaksi di mana ada unsur yang berfungsi sebagai donor elektron (zat pereduksi) dan lainnya sebagai reseptor elektron (zat oksidan).
Katalase adalah protein yang mengandung gugus prostetik dengan empat atom besi trivalen (Fe +++), oleh karena itu ia adalah homoprotein. Ion besi tetap teroksidasi selama reaksi.
Dapat dikatakan bahwa katalase adalah enzim detoksifikasi, karena fungsinya adalah untuk menghilangkan zat yang diproduksi selama metabolisme bakteri yang bersifat racun bagi bakteri. Di antara zat-zat ini adalah hidrogen peroksida.
Hidrogen peroksida terbentuk dari dekomposisi gula oleh rute aerobik. Proses ini terjadi sebagai berikut:
Ion superoksida (O 2 -) (radikal bebas) dibentuk sebagai produk akhir dari asimilasi glukosa oleh rute aerobik. Ini beracun dan dihilangkan oleh enzim superoksida dismutase yang mengubahnya menjadi gas oksigen dan hidrogen peroksida.
Hidrogen peroksida juga beracun bagi bakteri dan harus dihilangkan. Enzim katalase membuka hidrogen peroksida dalam air dan oksigen.
Katalase dapat bekerja pada substrat selain hidrogen peroksida, seperti alkohol, aldehida, asam, amina aromatik dan fenol. Namun, hidrogen peroksida juga dapat digunakan oleh katalase untuk mengoksidasi senyawa beracun lainnya seperti metil dan etil alkohol.
Demikian juga, katalase hadir dalam sel fagosit, melindunginya dari aksi toksik hidrogen peroksida.
Teknik rutin untuk uji katalase
Metode -Object
Material
3% hidrogen peroksida (10 volume).
Geser kaca
Gagang plastik sekali pakai atau tongkat kayu.
Prosedur
Ambil cukup koloni untuk dipelajari tanpa menyentuh agar-agar dari mana asalnya. Koloni harus segar, yaitu, dari budaya 18 hingga 24 jam.
Tempatkan koloni pada slide kering dan di atasnya tambahkan setetes hidrogen peroksida 3% (30% H 2 O 2 juga dapat digunakan). Amati segera jika gelembung dilepaskan atau tidak.
Interpretasi
Reaksi positif: evolusi gas, yang dibuktikan dengan pembentukan gelembung (gelembung kuat).
Reaksi negatif: tidak ada pembentukan gelembung.
- Metode langsung dalam budaya murni
Tempatkan 1 ml 3% H 2 O 2 pada kultur murni di piring atau irisan yang tidak mengandung darah (lebih disukai agar-agar yang bergizi). Amati apakah pembentukan gelembung ada segera. Anda juga dapat menggunakan H 2 O 2 pada 30%.
Ini ditafsirkan dengan cara yang sama seperti metode porting objek.
-Metode dengan tabung kapiler atau Fung dan Petrishko
Isi tabung kapiler 67 mm pada ketinggian 20 mm dengan hidrogen peroksida 3% dengan kapilaritas.
Sentuh koloni terisolasi yang ingin Anda pelajari dengan kapiler yang diisi 3% H 2 O 2 . Amati apakah kapiler terisi dengan gelembung dalam waktu sekitar 10 detik. Metode ini memungkinkan untuk mengukur semi-reaksi dalam salib:
Tanpa persilangan tidak ada gelembung (reaksi negatif).
+ ---- Sedikit gelembung (reaksi lemah atau tertunda).
++ Gelembung melimpah (reaksi sedang).
+++ - Gelembung mencapai ekstrim yang berlawanan (reaksi energetik).
Metode -Taylor dan Achanzar untuk tes katalase yang memberikan keraguan
Pada slide yang kering dan bersih, tempatkan koloni yang terisolasi, lalu tempatkan setetes 0, 5% H 2 O 2 dan tutup dengan kaca penutup. Amati apakah ada gelembung yang terperangkap atau tidak.
Interpretasi: kehadiran gelembung menunjukkan reaksi positif. Tanpa gelembung, itu ditafsirkan sebagai reaksi negatif.
Tes Catalase untuk spesies Mycobacterium
Teknik ini perlu dilakukan dengan mengendalikan pH dan suhu. Itu harus dijalankan di bawah tudung aliran laminar, karena penanganan spesies Mycobacterium yang berbeda berbahaya.
-Bahan
Hidrogen peroksida 30% atau 110 volume (superoksal).
PH 7 buffer fosfat
10% Tween 80
Budidaya baji Mycobacterium 3 hingga 4 minggu
-Persiapan reagen
PH 7 buffer fosfat
Timbang:
1, 361 g monopotassium fosfat anhidrat (KH 2 PO 4 ).
1, 420 g fosfat anhidrat (Na2HPO3).
Larutkan kedua garam dalam sedikit air suling steril dan lengkap dengan air hingga 1000 ml.
10% Tween 80
Buat pengenceran 1:10 ke Tween 80 yang terkonsentrasi secara komersial, jadi lakukan sebagai berikut:
Ambil 1 ml Tween 80 dan letakkan dalam sedikit air suling, larutkan dan lengkapi volume dengan air hingga 10 ml.
Pereaksi akhir
Campurkan sejumlah buffer fosfat dengan jumlah 10% Tween 80 (dalam bagian yang sama). Tentukan di laboratorium berapa banyak yang ingin Anda persiapkan.
- Prosedur
Tempatkan 5 ml buffer fosfat dalam tabung reaksi steril dengan tutup ulir (Bakelite).
Dengan loop inokulasi, ambil cukup koloni dari pertumbuhan Mycobacterium yang diunggulkan dalam irisan dan larut dalam buffer fosfat.
Tutup tabung tanpa mengencangkan benang terlalu banyak. Tempatkan dalam bak air pada suhu 68 ° C selama 20 hingga 30 menit. Angkat dan biarkan dingin pada 22-25 ° C
Ukur 0, 5 ml reagen akhir (campuran) dan tambahkan ke tabung dengan larutan dingin. Amati formasi atau tidak dari gelembung.
Ini ditafsirkan seperti teknik sebelumnya.
Gunakan
Ketika pertumbuhan koloni dalam media yang diperkaya diperoleh, pewarnaan Gram dan uji katalase harus dilakukan pada koloni yang diperoleh. Ini akan memandu ahli mikrobiologi tentang prosedur yang harus diikuti untuk identifikasi definitif.
Kontrol kualitas
Untuk mengevaluasi berfungsinya reagen hidrogen peroksida, gunakan strain kontrol yang baru dikultur, seperti Staphylococcus aureus sebagai kontrol positif dan strain Streptococcus sp sebagai kontrol negatif.
Alternatif lain yang berfungsi sebagai kontrol positif adalah menempatkan setetes hidrogen peroksida pada agar darah, eritrosit memiliki katalase, oleh karena itu, akan terjadi gelembung jika reagen dalam kondisi baik.
Agar coklat dapat digunakan sebagai kontrol negatif, di sini eritrosit sudah dilisiskan dan tes negatif.
Keterbatasan
-Jangan gunakan kultur lama untuk pengujian, karena ini dapat menyebabkan negatif palsu.
-Hindari mengambil koloni dari kultur agar darah, jika hati-hati jangan sampai menyentuh agar-agar; prosedur ini dapat menyebabkan positif palsu, karena eritrosit mengandung katalase.
-Jika Anda mengambil koloni dengan pegangan platinum jangan membalik urutan prosedur karena ini dapat menghasilkan positif palsu. Ini karena platinum mampu bereaksi dengan hidrogen peroksida, menyebabkan gelembung.
-Jangan gunakan reagen hidrogen peroksida jika terlalu tua, karena reagen sangat tidak stabil dan cenderung terurai dengan waktu.
-Jaga reagen hidrogen peroksida terlindung dari cahaya dan pendinginan untuk menghindari kerusakan.
- Lakukan kontrol kualitas reagen hidrogen peroksida setiap kali digunakan.
- Perhatikan bahwa jika H 2 O 2 digunakan pada 30%, reaksi lebih kuat daripada yang dibuat dengan 3% H 2 O 2 .
