Malonato broth: fondasi, persiapan, dan penggunaan

Malonate broth adalah media kultur cair yang digunakan untuk uji diagnostik (malonato test), yang digunakan untuk membedakan beberapa genera dari famili Enterobacteriaceae. Itu dibuat oleh Leifson pada tahun 1933 dan kemudian dimodifikasi oleh Ewing, yang menambahkan sejumlah kecil dekstrosa dan ekstrak ragi ke formula asli.

Media saat ini terdiri dari ekstrak ragi, amonium sulfat, dipotassium fosfat, monopotassium fosfat, natrium klorida, natrium malonat, dekstrosa dan bromotimol biru. Tes ini biasanya termasuk dalam baterai identifikasi biokimia untuk Enterobacteria, membantu membedakan genera dan spesies tertentu.

Uji malonat didasarkan terutama pada kemampuan beberapa mikroorganisme untuk menggunakan natrium malonat sebagai sumber karbon tunggal dan amonium sulfat sebagai sumber nitrogen.

Tes malonat biasanya positif pada beberapa spesies dari genera Enterobacter, Klebsiella dan Citrobacter. Sementara, sebagian besar spesies dari genera Escherichia, Salmonella, Shigella, Edwardsiella, Yersinia, Serratia, Morganella, Proteus dan Providence, memberikan reaksi negatif.

Yayasan

Uji malonat terdiri dari menunjukkan bakteri yang mampu menggunakan natrium malonat sebagai satu-satunya sumber karbon dan amonium sulfat sebagai sumber nitrogen.

Mayoritas enterobacteria yang tidak menggunakan malonat dapat tumbuh di media ini, menggunakan dekstrosa dan ekstrak ragi sebagai nutrisi.

Dalam hal ini, setiap upaya untuk membuat alkali dengan menggunakan pepton akan dinetralkan dengan produksi asam yang dihasilkan oleh fermentasi dekstrosa. Demikian juga, dipotassium dan monopotassium fosfat bertindak sebagai penyangga menjaga pH pada 6, 7.

Itu sebabnya, ketika tes negatif, kaldu adalah warna asli yang sama (hijau). Dalam kasus yang jarang, media dapat diasamkan karena fermentasi dekstrosa; tanpa menggunakan pepton dan indikator pH akan mengubah warna medium menjadi kuning. Agar ini terjadi, pH harus turun ke 6.

Sekarang, ketika tes ini positif, dikatakan bahwa mikroorganisme menggunakan malonat dan amonium sulfat masing-masing sebagai sumber karbon dan nitrogen, tanpa memanfaatkan komponen lainnya.

Dalam hal ini, media menjadi basa karena pelepasan natrium dan pembentukan NaOH. Dalam pengertian ini, indikator pH (bromothymol blue) mengubah warna dari hijau ke biru ketika pH sama atau lebih besar dari 7, 6. Biru mungkin jelas atau intens (biru Prusia).

Akhirnya, natrium klorida mempertahankan osmolaritas medium dan air adalah pengencer semua komponen.

Interpretasi

Kaldu dengan warna yang sama (hijau): tes negatif

Kaldu kuning: tes negatif

Biru muda atau kaldu intens: bukti positif

Ada varian yang disebut kaldu fenilalanin malonat, juga disebut medium Shaw dan Clarke. Dalam hal ini, dua tes dapat dianalisis, penggunaan malonat sebagai sumber karbon dan produksi asam piruvat dari fenilalanin.

Persiapan

Kaldu malonato

Jumlah gram yang ditentukan oleh sisipan dari rumah komersial yang dipilih ditimbang (dapat bervariasi dari satu ke yang lain). Berat gram disuspensikan dalam satu liter air suling. Panaskan sedikit sampai benar-benar larut. Distribusikan 3 ml media dalam 13/100 tabung reaksi dengan penutup kapas.

Sterilkan dalam autoklaf pada 121 ° C selama 15 atau 20 menit.

Dinginkan sebelum digunakan. Jika tidak akan segera digunakan, simpan di lemari es sampai digunakan. Marah kaldu pada suhu kamar sebelum diinokulasi.

PH medium harus 6, 7 ± 0, 2. Warna media yang disiapkan adalah hijau botol.

Kaldu fenilalanin malonat

Timbang 11 g medium dehidrasi dan larutkan dalam 1 liter air suling. Sisa persiapannya sama dengan yang dijelaskan di atas.

Ini juga dapat dibuat dengan menambahkan 2 gr / L fenilalanin ke dalam medium kaldu malonat sebelum disterilkan.

Gunakan

Ini digunakan sebagai bagian dari baterai tes biokimia yang dikumpulkan untuk identifikasi bakteri dari keluarga Enterobacteriaceae.

Bantu membedakan antara:

- Genus Klebsiella dan Enterobacter (+) dari genus Escherichia dan Serratia (-).

- Spesies Salmonella enterica ssp arizonae, Salmonella enterica ssp salame dan Salmonella enterica ssp diarizonae (+), dari spesies Salmonella enterica ssp enterica (-).

-Dari genus Klebsiella umumnya (+) dari genus Actinobacillus (-).

-Ini kadang-kadang dapat membantu diferensiasi genera dan spesies bakteri yang tidak termasuk dalam keluarga Enterobacteriaceae, seperti antara basil negatif Gram yang tidak berfermentasi Alcaligenes faecalis (+) dan Acinetobacter sp (-).

Prosedur

Di bawah korek api, sebagian koloni murni diambil, menggunakan pegangan platinum yang disterilkan dan didinginkan. Sampel yang diambil (inokulum cahaya) dilarutkan dalam kaldu malonat. Itu diinkubasi dengan tutup longgar di aerobiosis pada 35 ° C ± 0, 2 selama 24 hingga 48 jam.

Kaldu malonat juga dapat diinokulasi dari kultur 18-24 jam dalam kaldu kedelai trypticase. Dalam hal ini, 0, 01 ml diambil dengan pipet steril dan kaldu malonat diinokulasi. Itu diinkubasi dengan tutup longgar di aerobiosis pada 35 ° C ± 0, 2 selama 24 hingga 48 jam.

Pada akhirnya hasilnya ditafsirkan. Setiap jejak warna biru memuncak setelah 48 jam inkubasi harus dianggap positif. Tes tidak boleh ditafsirkan sebagai negatif sampai waktu inkubasi 48 jam telah selesai.

Dalam kasus menggunakan varian kaldu fenilalanin malonat, malonat pertama-tama ditafsirkan dan kemudian ditambahkan 5 tetes HCl 1N dan 3-5 tetes besi klorida 8% ditambahkan. Warna hijau tua ditafsirkan sebagai tes positif untuk fenilalanin. Di sisi lain, jika media berubah menjadi biru pucat, tes ini negatif untuk fenilalanin.

Kontrol kualitas

Untuk melakukan kontrol sterilitas medium, satu atau dua kaldu harus diinkubasi pada 35 ° C ± 0, 2 selama 24 jam inkubasi. Pada akhir waktu ini seharusnya tidak ada kekeruhan, tidak ada perubahan warna.

Untuk kontrol kualitas, galur yang dikenal atau bersertifikat dapat digunakan, seperti: Enterobacter aerogenes ATCC 13048, Klebsiella pneumoniae ATCC 33945, Salmonella enterica ssp arizonae ATCC 13314 dan Escherichia coli ATCC 25922.

Hasil yang diharapkan adalah:

Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae dan Salmonella enterica ssp arizonae memberikan reaksi positif (warna biru sedang).
Untuk Escherichia coli hasilnya harus negatif, yaitu, diharapkan tidak ada perubahan warna (hijau) atau berubah menjadi kuning karena fermentasi glukosa.